乳与乳制品三聚氰胺检测方法的探讨
____梁宝爱（山西省食品质量监督检验中心）
三聚氰胺(cyanuramide)，分子式C3H6N6，又称蜜胺，2，4，6一三氩基一1，3，5一三嚎，白色单斜棱晶。三聚氰胺作为一种化工原料，在塑料，涂料，粘合剂等行业广泛应用，三聚氰胺是某些农药和化肥的原料和代谢产物，也是食品包装材料的原料。根据世界卫生组织 专家估计和我国已有检测结果，采用三聚氰胺—甲醛树脂制作的食品餐具在与食品接触时会有微量的三聚氰胺迁移出来，因此，三聚氰胺在环境中存在。以上这些因素均可导致食品中可能含有微量三聚氰胺。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，严禁人为添加到食品中。人为在食品中添加三聚氰胺是一种违法行为。鹿牌婴幼儿奶粉事件\"的发生就是不法分子在原料乳中 掺水，以增加重量牟取非法利益的后果。奶掺水后会造 成原料乳中蛋白质含量下降，为掩盖非法行为，虚增牛 奶中蛋白质检出量，不法分子人为在原料乳中加入三聚 氰胺。临床调查发现，三聚氰胺对人体的影响是有可能 在泌尿系统形成泥沙样结晶或结石。如果摄入的三聚氰 胺量大，时间长。可能会在泌尿系统如膀胱和肾脏形成 泥沙样结晶或结石。由于婴幼儿生理结构和饮食结构与 成人明显不同，含三聚氰胺的奶粉对不同人群健康的影 响也不同。婴幼儿比较容易引起泌尿系统结石，而成人 摄入三聚氰胺引起泌尿系统结石的可能性很小。 2008年10月7日，卫生部等5部门联合发布公告， 确定了乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值，即婴幼 儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，液态奶(包 括原料乳)，奶粉，其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。目前，我国对三聚氰胺检测规定了3种方法，分别是高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱一质谱 法 (GC—MS) 和液相色谱一质谱/质谱法 (LC—MS/MS)，其定量限(精确度)分别为2 mg/kg，0.05 mg/kg，0.01 mg/kg。只要检验样品中三聚氰胺真实含量在检测方法定量限以上，检测方法就能准确检出。企业和监管机构应根据检测对象及临时管理限量值要求，选用与其相适应的检测方法。但实验发现，样品前处理十分关键，直接影响其准确度及时效性。下面就高效液 相色谱法(HPLC)的3种前处理方法进行比较，供各实验室参考。
实验方法
(以液态奶，全脂奶粉，冰淇淋，奶糖为例)
1、主要试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯，水符合GB/T 6682 规定的三级水，色谱用水符合一级水的规定。 本方法所用主要试剂及标物有乙腈(色谱纯)，甲醇 (色谱纯)，氨水浓度(25%～28%)，混合型阳离子交换 固相萃取小柱(60 mg/3 mL)，三氯乙酸溶液(10 g/L)， 磺基水杨酸溶液(60 g，L)，盐酸溶液(0.1 moVLl，氨水 甲醇溶液(5%)，乙酸铅溶液(22 g/L)，甲醇水溶液 (1:1)，离子对试剂缓冲液(准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠，加入约980 mL水溶解，调pH3.0， 定容至1 L备用)，三聚氰胺标准品(纯度大于99%)， 三聚氰胺标准贮备液1 mg/mL(甲醇水溶液定容，于 4℃避光保存)。
2、主要仪器设备 高效液相色谱仪(HPLC)仪(配有紫外检测器)， 超声波水浴，固相萃取装置，分析天平(感量0.1 mg)， 氮气吹干仪，离心机(I>4 000 r/min)，涡旋混合器，具 塞塑料刻度离心管(50 mL)。 3、样品前处理 方法一
原理：试样用三氯乙酸溶液一乙腈提取，经阳离子 交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱进行测定，外 标法定量。
提取：称取2 g试样(精确到0.01 g)试样于50 mL 具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液(10 g/L)和5 mL乙腈，超声提取10 min，震荡提取10 min后，以 8 000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液湿润的滤纸过滤后用三氯乙酸溶液定容至25 mL，再移取5 mL 滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。
净化：将待净化液转移至已活化的固相萃取小柱中。 依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干之后，再用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。在整个固相萃取过程中，流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物(相当于0.4 g样品)用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。 方法二
原理：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱进行测定，外标法定量。
提取：称取2 g试样(精确到0.01 g)试样于50mL 具塞塑料离心管中，再准确加入25 mL三氯乙酸溶液(10 g/L)和2 mL乙酸铅(22 g/L)，混匀后，超声波振
荡器中超声提取20 min。以8 000r/mjn离心10 min。移取5 mL上清液做待净化液。
净化：同方法一 方法三
原理：试样经溶解，超声提取，沉淀蛋白，过滤得 到测试液，经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外 吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。
提取：称取2 g试样(精确到0.01 g)试样于50 mL 具塞塑料离心管中，加入0.1 moI/mL盐酸溶液25 mL， 涡旋混匀，超声提取30 min后加入60 g/L磺基水杨酸20 mL，用0.1 mol/mL盐酸定容至500 mL，然后，再以 8 000 r/min离心10 min。移取5 mL上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。 4、测定 (1)色谱条件
a)色谱柱：C18柱，250mm×4。6mm(i，d)，5μm。
b)流动相：离子对试剂缓冲液(3.12)—乙腈 (85+15，体积比)，混匀。 c)流速1.0 mL/min，柱温40℃，波长240 nm，进样量20 L。
(2)标准曲线的绘制：用流动相将三聚氰胺标准储备 液逐级稀释得到浓度为0.8 g/ml，2 g/m，20 g/m，40 g/m，80 g/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以蜂面积—浓度作图，得到标准曲线回归方程。
(3)定量测定：待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后在进样分析。同时做空白试验(除不称取样品外，均按上述测 定条件和步骤进行)。 5、结果计算
试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按下 式计算：
X=（C×V/m）×n
式中：X—试样中三聚氰胺的含量(mg/kg); C—标准工作液中三聚氰胺的浓度(¨μg/mL) V—样液最终定容体积(mL); m—试样的质量(g); n—稀释倍数。
结果与讨论 1、精密度测定
按照本文中方法一，二，三规定的前处理条件测定纯牛奶，全脂奶粉，冰淇淋，奶糖4种样品中三聚氰胺的含量，各进行6次平行测定，得到如表1所示的结果。 表1数据显示，用3种方法测定4种不同基质样品的测量值的相对标准偏差(RSD%)在1.9%一2.7%之 间，3种方法的适用性较好，但方法一对冰淇淋，奶糖前处理不易过滤，时间长，难操作。 2、回收率测定
在上述纯牛奶，全脂奶粉，冰淇淋，奶糖等样品中 添加一定量三聚氰胺标准溶液分别按照本标准方法一， 二，三规定的前处理条件进行回收率测定，得到如表2 所示的结果。 表2数据显示，用3种方法对纯牛奶，全脂奶粉， 冰淇淋，奶糖等不同基质样品进行加标测得回收率，表明纯牛奶，全脂奶粉样品回收率均在88%～103%之间，冰淇淋，奶糖样品方法—回收率均小于80%，方法二回收率均大于85.0%，方法三回收率均大于80.0%。 结论
大量实验表明，定量检测纯牛奶，全脂奶粉样品中的三聚氰胺采用本文中介绍的3种方法，其相对平均偏差RSD80%，准确度高，重现性好，方法适用性好。 定量检测冰淇淋，奶糖样品中的三聚氰胺，方法一准确度差，不可操作，且时间长；方法二准确度高，重现性好，效率较高；方法三准确度较高，重现性较好， 且效率高，成本低。
