Drebrin和SYP在APP_PS1转基因AD小鼠海马内的表达与认知障碍的关系

神经解剖学杂志(ChineseJournalofNeuroanatomy)

Drebrin和SYP在APP/PS1转基因AD小鼠海马内的表达与认知障碍的关系

柴继侠

1,2

　姚君茹　于剑锋　陈明军　徐冲冲　朱新平

31313

陈祖林　李瑞锡　彭裕文

11111

(1复旦大学上海医学院　解剖与组织胚胎学系,上海200032;2蚌埠医学院　组织胚胎学教研室,蚌埠233030;

3

洛克菲勒大学　神经生物学和遗传学实验室,纽约10021)

摘　要　已知Alzheimer病(AD)患者脑内的主要病理变化之一是树突棘与突触的退化,而树突棘与突触的正常发育及病理改变均与树突棘肌动蛋白结合蛋白drebrin和突触前成分内突触素(synaptophysin,SYP)的表达水平密切相关。为探讨drebrin和SYP的表达与AD认知障碍之间的关系,本实验先采用Morris水迷宫法观测了6、9、12月龄APP/PS1转基因小鼠和同种野生型小鼠的学习记忆能力;再用Westernblot法检测了其海马内drebrin和SYP蛋白表达水平。结果显示:9月龄APP/PS1转基因小鼠海马内drebrin蛋白的表达水平已有下降,其学习记忆能力也相应地降低,12月龄时二者下降明显;但作为突触前成分中的SYP蛋白表达水平的下降则较前二者的出现为迟。本结果提示,drebrin的表达下降在AD早期行为学改变的分子机制中发挥重要的作用,而SYP的表达下降则在drebrin下降之后参与AD的进一步发展。

关键词　　肌动蛋白结合蛋白　突触素　Alzheimer病　水迷宫　APP/PS1转基因　小鼠RelationshipbetweentheexpressionsofdrebrinandSYPinhippocampuswith

cognitivedeclineinanAPP/PS1transgenicmodelofADmouse

ChaiJixia

1,2

,YaoJunru,YuJianfeng,ChenMingjun,XuChongchong,

1

3

1

1

1111

ZhuXinping,ChenZulin,LiRuixi,PengYuwen

23

(1DepartmentofAnatomy,HistologyandEmbryology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032;

DepartmentofHistologyandEmbryology,BengbuMedicalCollege,Bengbu233030;LaboratoryofNeurobiologyandGenetics,TheRockefellerUniversity,NewYork10021)

Abstract　IthasbeenwellknownthatthedegenerationofthedendriticspineandsynapseisoneofthemajorpathologicalchangesinthebrainswithAlzheimerdisease(AD),whichiscloselyrelatedwiththeexpressionlevelsofthedrebrin,anactinbindingprotein,andthesynaptophysin(SYP)locatedinthepresynapticelement.InordertounderstandtherelationshipbetweentheexpressionsofthedrebrinandSYPwiththecognitivedeclineinAD,thepresentstudyexaminedtheexpressionsofthedrebrinandSYPinhippocampusbymeansoftheWesternblotintheAPP/PS1transgenicmouseaged6,9and12monthsaftertheanimalsweretestedfortheabilityinlearningandmemo2rybyaMorriswatermaze.TheresultsrevealedthattheexpressionlevelofthedrebrininhippocampuswasdecreasedandtheabilityinlearningandmemorywasaccordinglydecreasedintheAPP/PS1transgenicmouseaged9months,andthedecreasesbothinexpressionofthedrebrinandinlearningandmemoryweremoreobviousinthemouseaged12months.However,theexpressionleveloftheSYPdescen2dedmuchlatercomparedwiththedecreasesofthedrebrinandtheanimalcognition.TheseresultsindicatethatthedecreaseofthedrebrinmightplayanimportantroleinthemolecularmechanismsunderliningthedeclineincognitionattheearlystagesofAD,whilethedecreaseoftheexpressioninSYP,whichfollowstheexpressionchangeofthedrebrin,mightparticipateinthefurtherdevelopmentofAD.Keywords　　drebrin,synaptophysin,Alzheimerdisease,Morriswatermaze,APP/PS1transgenicmouse

　　3　通讯作者　李瑞锡　电话:02125423715129308　E2mail:ruixilee@shmu.edu.cn

彭裕文　电话:021254237445　E2mail:ywpeng@fudan.edu.cn

274神经解剖学杂志　　第25卷　　第3期　　2009年5月

　　Alzheimer病(AD)患者脑内的主要病理变化,

光镜细胞水平表现为神经元外β2淀粉样蛋白沉积形成老年斑,神经元内神经原纤维缠结,神经元丢失;电镜亚细胞水平则为突触的退化、萎缩和丢失。突触的这些变化发生在AD的早期,最先累及树突棘,出现树突棘发育不良和萎缩。由于树突棘是突触的突触后结构,因而树突棘的形态异常,必定影响突触的整体结构和功能。树突棘与突触的变化一直

[125]

持续到AD晚期,与认知障碍的发展密切相关。

树突棘的异常变化与一种肌动蛋白结合蛋白2drebrin的表达异常有关。生理情况下,drebrin主要在神经元树突棘内表达,通过与纤维型肌动蛋白的

[6]

结合或解离,调节树突棘的形态和可塑性。研究显示,AD患者大脑皮层和海马内drebrin表达减[7,8]少。因此认为,drebrin可能通过影响树突的形

[9,10]

态结构进而造成突触的改变,参与AD的发病。突触素(synaptophysin,SYP),是一种膜蛋白,存在于突触前成分的突触囊泡上,参与囊泡的转运、导入和神经递质的释放,参与突触囊泡的再循环维持突触的功能。SYP作为突触囊泡膜的分子标记,其表达的水平能有效地反映突触的结构和功能状[11213]态。据上述可以推定:AD患者脑内drebrin表达下降,影响树突棘的发育形成;树突棘的发育障碍又导致突触的整体异常;突触的异常,定会表现出SYP的表达异常。然而,AD患者脑内drebrin的表达变化与SYP的表达以及学习记忆障碍之间的关系,目前尚不清楚。

为探讨这一问题,本实验采用APP/PS1转基因AD模型小鼠,观测了其学习记忆能力;检测了其海马内drebrin和SYP的表达水平,分析比较了drebrin和SYP的表达变化与学习记忆障碍之间的关系。

25℃的室舍中,自由摄食和饮水。动物喂养程序按

照复旦大学实验动物保护条例执行。2.　主要试剂与仪器

小鼠单克隆drebrin抗体(1∶500,Abcam);兔多克隆SYP抗体(1∶1000,Abcam);兔多克隆GAPDH抗体(1∶1000,Chemicon)。HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1000,Aggen);HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶2000,Sigma);蛋白分子量Marker(Fermen2tas);蛋白酶抑制剂和蛋白浓度测定的BCA试剂盒(申能生物科技有限公司),Westernblot的电泳和转膜装置(BIO2RADMiniprotein)、PVDF膜(Total2blottm),Morris水迷宫装置(上海吉量软件科技有限

公司)等。

3.　Morris水迷宫的行为学测试

分别取6、9、12月龄的APP/PS1和WT小鼠各5只,用于行为学测试。Morris水迷宫装置由一个直径160cm、高55cm的圆形水池组成,水深41cm,池壁上由东、西、南、北4个等距离点将池分为SW、NW、SE及NE4个象限,在NE象限正中距离池壁35cm处放一直径8cm、高40cm的圆形平台,平台

低于水面1cm。水迷宫所在房间的水池周围用白色丝帘围住,训练期间参照物和训练者位置保持不变,室内保持安静。实验历时4d,每天分上、下午2个时段,共8个时段,每时段测试2次。小鼠运动轨迹由水迷宫上方连接于显示系统的摄像机采集。训练时选择一个象限开始,将小鼠从象限边缘中点位置面向池壁放入水中,观察并记录在60s内找到平台的时间(逃避潜伏期)。再选择和第一个象限与平台等距离的另一个象限,观察小鼠找到平台的时间。30min后重复一次。如果小鼠在60s内未能找到平台,则人为引导至平台停留10s后移开,时间记为60s。这种定位航行实验,主要用于测量小鼠的学习和记忆能力。实验结果用SPSSl2.0的软件进行统计学分析。4.　免疫印迹检测

将6、9、12月龄的经过水迷宫测试的APP/PS1和WT小鼠(各月龄分别为5只),按以下步骤作Westernblot检测。4.1　样品的制备

材料和方法

1.　实验动物

采用APP/PS1双转基因AD模型小鼠(从美国

洛克菲勒大学神经生物学和遗传学实验室引进,在本课题组繁殖饲育)。通过对幼鼠进行基因型鉴定,确定APP/PS1转基因小鼠。步骤为:提取鼠尾组织DNA,用特定引物进行PCR扩增,扩增产物中含有608个bp者即为APP/PS1鼠,否则为同种野生型鼠(WT),设其为对照鼠。本实验对6、9、12月龄的APP/PS1和WT小鼠进行了检测,每个月龄段各为5只。小鼠分笼喂养于明、暗12h相间、室温

将不同月龄的APP/PS1和WT小鼠迅速断头、

去除颅骨,剥除脑膜,暴露脑,分离出海马,经0.01mol/LPBS清洗后,置于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中,按1ml裂解液/100mg海马组织加入,匀浆后冰上静置30min;沸水煮5min;12000r/min

柴继侠等:Drebrin和SYP在APP/PS1转基因AD小鼠海马内的表达与认知障碍的关系275

4℃离心30min;取上清液,弃沉淀,小部分上清液用

有统计学意义。

于蛋白质浓度的测定(BCA法测定),大部分上清液置-80℃冰箱中备用。4.2　Westernblot

结　　果

1.　Morris水迷宫

Morris水迷宫检测结果显示,随测试次数的增

根据测得的蛋白质浓度,计算出各样品的上样量。常规电泳转膜后,用5%脱脂牛奶封闭,加一抗4℃孵育过夜。洗膜后,用HRP标记的二抗室温下孵育2h。ECL发光液孵育、胶片曝光、显影、定影。扫描仪扫描X光片。用BIO2RADQuanlityOne4.5.0软件检测目的蛋白drebrin和SYP的条带及内参GAPDH条带的灰度值,目的蛋白灰度值和内参灰度值的比值,作为目的蛋白drebrin和SYP表达的相对水平。5.　统计学分析

加,WT小鼠寻找平台所需时间逐渐缩短。6月龄

时,APP/PS1转基因小鼠寻找平台所需时间与同龄WT小鼠无明显差异(P>0.05;Figs.1A,D)。而9月龄(Figs.1B,D)和12月龄(Figs.1C,D)时,APP/PS1转基因小鼠寻找平台所需时间与同龄WT小鼠相比明显延长(P<0.05和P<0.01)。组内统计分

实验数据用SPSSl2.0软件进行统计学分析,结果用均数±标准误(x󰁡±Sx󰁡)表示。组间资料用两样本的t检验分析,组内资料用单因素方差分析(ANOVA)。数据之间的差异,P<0.05,认为差异

析显示(Fig.1D):对照组WT小鼠寻找平台时间,不随鼠龄增大而变化(P>0.05);而在APP/PS1转基因模型组寻找平台的时间,9月龄及12月龄小鼠分别比6月龄者有显著(P<0.05)和非常显著(P<0.01)的延长。

Fig.1　GraphsshowingtheresultsofMorriswatermazetest.A,B,CshowingtheescapelatencyatdifferenttrainingblocksinAPP/PS1

transgenicmouseandWTmouseaged6,9and12months(3,33:P<0.05andP<0.01,comparedwithWTmouse);Dshowingthestatisticanalysisofthemeanescapelatency.

2.　免疫印迹检测2.1　Drebrin免疫印迹

Westernblot结果显示(Fig.2),APP/PS1小鼠

海马内drebrin蛋白的相对水平在6月龄时和同龄

276神经解剖学杂志　　第25卷　　第3期　　2009年5月

WT小鼠相似(P>0.05),9月龄时比同龄WT小鼠

有所降低(P<0.05),12月龄时则有明显的降低(P

<0.01)。组内统计分析结果可见,APP/PS1小鼠随月龄的增加,海马内drebrin蛋白的表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig.3　WesternblotassayshowingtheexpressionofSYPinhippo2

campusinAPP/PS1transgenicmouseandWTmouseaged6,9and12months.A:Representativeimmunoblotsofpro2teinextractsforSYP.GAPDHwasassayedascontrolforproteinloading;B:QuantitativeanalysisofimmunoblotsforSYP(3P<0.05,comparedwithWTmouse;#P<0.05,compared9monthswith12monthsAPP/PS1mouse,n=5).

Fig.2　Westernblotassayshowingtheexpressionofdrebrininhip2

pocampusinAPP/PS1transgenicmouseandWTmouseaged6,9and12months.A:Representativeimmunoblotsofproteinextractsfordrebrin.GAPDHwasassayedascon2trolforproteinloading;B:Quantitativeanalysisofimmuno2blotsfordrebrin(3,33P<0.05andP<0.01,com2paredwithWTmouse;#P<0.05,comparedamongthe6,9and12monthsAPP/PS1mouse,n=5).　　Drebrin是一种肌动蛋白结合蛋白,在成熟的神经元内存在于树突棘中,通过与纤维型肌动蛋白的结合或解离,对树突棘的形成及其可塑性发挥作[6]

用。树突棘是神经元树突上的棘状微小突起(Fig.4A),构成突触的突触后成分。树突棘内的结构主要是肌动蛋白细胞骨架和突触后致密物及神经递质受体等,是维持突触基本形态和功能的主要成分。SYP是一种分子量为38kD的钙结合蛋白,特异性地位于轴突终末内的突触囊泡膜上,其主要功能是参与通道的形成、囊泡膜的融合以及Ca依赖性神经递质的释放过程。SYP的表达和突触的形成是一致的,突触重建时SYP含量明显增多。因而,

[11213]

SYP是突触结构和功能的重要标志。生理情况下,drebrin调节树突棘的发育形成,发育良好的树突棘又为突触前成分的发育奠定了基础,发育完整而成熟的突触是维持神经系统生理功能的前提。

本实验结果显示6月龄时,APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力、海马内drebrin和SYP的表达水平与同龄的WT小鼠相比,差异均无统计学意义(P>0.05),说明此时的小鼠神经系统完全正常而健康。6月龄的小鼠相当于人类的中年期,所以可以推测AD患者,在其中年期也没有学习记忆等行为异常(实际情况也是如此)及海马内drebrin和SYP的表达异常,因此推测此时AD患者的海马内突触结构也不会出现形态异常(Fig.4A,B)。

2+

2.2　SYP免疫印迹Westernblot结果显示(Fig.3),APP/PS1小鼠

海马内SYP的相对水平和同龄WT小鼠相比,6月

龄和9月龄时差异均无统计学意义(P>0.05),12月龄时有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。组内统计分析结果可知,12月龄的APP/PS1小鼠与6、9月龄者相比,海马内SYP蛋白的表达量明显降低(P<0.05)。

讨　　论

为探讨drebrin和SYP的表达与AD认知障碍

之间的关系,本实验采用了APP/PS1转基因AD小鼠模型,检测了小鼠的学习记忆能力和海马内dre2brin和SYP的表达水平。结果显示,APP/PS1转基因AD小鼠从9月龄时,学习记忆能力已经下降,drebrin的表达也明显下降,而SYP的表达变化较前

两项变化发生为迟。现就结果讨论如下:1.　转基因小鼠6月龄时drebrin和SYP的表达以

及记忆力无异常

柴继侠等:Drebrin和SYP在APP/PS1转基因AD小鼠海马内的表达与认知障碍的关系277

Fig.4　AschemashowingthechangesofthesynapticstructuresinhippocampusinAPP/PS1transgenicmouse.Ashowinganeuronre2

ceivingsynapticinputs;BshowingthenormalsynapsesbeforeappearingADsymptom;CshowingabnormaldendriticspinewithnormalpresynapticelementandnormallevelofSYPspeculatingontheAPP/PS1mouseaged9months;Dshowingthewholesyn2apticdegenerationwithlowerleveloftheSYPspeculatingontheAPP/PS1mouseaged12months.

2.　转基因小鼠9月龄后drebrin和记忆力明显下

降

本结果显示,相当于人类老年早期的9月龄APP/PS1转基因小鼠,其海马内drebrin的表达水平明显下降(P<0.05),学习记忆能力也明显下降(P<0.05),表明9月龄的APP/PS1转基因小鼠海马内drebrin水平已经发生了改变,而且这种改变似乎与动物的学习记忆能力的下降平行出现。然而,此时APP/PS1转基因小鼠海马内SYP水平,与WT小鼠相比,却没有明显变化(P>0.05),说明在AD发病早期,虽有突触后成分的树突棘受累,并出现认知障碍,但突触前成分尚无明显变化(Fig.4C)。这一

[14]

结果与Calon等的报道相似,他们的研究曾显示Tg2576小鼠大脑皮层内SYP水平无明显变化时,drebrin水平则已经明显降低。APP/PS1转基因小鼠脑内这种突触前、后蛋白不对称的变化提示:SYP的表达水平不能完全、及时地反映突触的功能;突触机能障碍及认知障碍远远早于SYP的表达下降。然而,由本实验结果可以推断:突触功能障碍与认知缺失,对drebrin的表达下降却很敏感。由于drebrin可调节肌动蛋白骨架结构,维持和调节树突棘的形

态与可塑性,所以drebrin水平任何程度的下降,必定直接导致树突棘的形态异常,如树突棘塌陷和萎缩(Fig.4C),此时,即使突触前成分尚无明显变化,如本实验结果所示,即无SYP的变化,突触的功能异常、出现认知障碍等AD症状也在所难免。我们的结果与推断与以往其它方法的研究结果相一

[17]

致:Ferrer和Gullotta使用Golgi染色方法显示,AD患者海马内神经元树突棘数量减少;本课题组用同法显示APP/PS1转基因AD小鼠海马神经元

[18][19]

树突变形和紊乱;Jacobsen等的研究显示,4月龄(AD早期)Tg2576小鼠海马内树突棘密度也明显减少;6月龄基因敲入的APP/PS1模型小鼠大脑皮层内drebrin阳性树突棘比例比野生型小鼠明显

[20]

减少。我们的结果及上述这些资料充分说明:AD发病早期就有drebrin水平的下降,同时出现树突棘的变化。因此可以推测,drebrin下降、树突棘蜕变与认知缺失,可能平行存在和发展。3.　转基因小鼠drebrin和记忆力显著下降后SYP

表达下调

本实验结果显示,相当于人类老年期的12月龄APP/PS1转基因小鼠海马内drebrin表达水平呈显

[15,16]

278神经解剖学杂志　　第25卷　　第3期　　2009年5月

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地显著下降,而此时SYP的表达水平也出现有统计学意义的下降(P<0.05),这说明随着疾病的进一步发展,12月龄的APP/PS1转基因小鼠已发生了显著的突触改变和行为损害。始于突触后树突棘结构的改变已明显影响到了突触前成分的改变,并表现出SYP的表达下降,最终导致突触进一步损伤,以致突触丢失(Fig.4D)。本实验观察到的SYP的这一变化与以往形态学研究的结果相似:例如,电镜显示APP/PS1转基因AD小鼠海马内突触稀疏、形态

[21]

不一。

本实验的这部分结果进一步说明,SYP的表达下降远迟于drebrin的下降,drebrin下降导致突触后树突棘的变化,最终引起突触前成分的改变,从而表现出SYP表达的下降。由此提示SYP的表达一旦下降,即反映突触整体萎缩、蜕变以至丢失过程的启动和认知障碍的加剧。因此我们可以得出结论:APP/PS1转基因小鼠脑内树突棘蛋白drebrin的表达下降似乎与动物学习记忆能力的下降平行出现和发展,而突触前成分中SYP的变化则较前二者为迟。

致谢　　感谢本系06级博士研究生刘妍同学在动物水迷宫检测实验中的帮助。参　考　文　献

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